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(12) NACH DEM VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ZUSAMMEN ARBEIT AUF DEM GEBIET DES
PATENTWESENS (PCT) VEROFFENTLICHTE INTERNATIONALE ANMELDUNG
(19) Weltorganisation fOr geistiges Eigentum
Internationales Biiro
(43) Internationales Veroffentlichungsdatum (10) Internationale Veroffentlichungsnummer
io. Juii 2003 (10.07,2003) pct WO 03/056330 A2
(51) Internationale Patentklassifikation 7 : G01N 33/50
(21) Internationales Aktenzeichen: PC17EP02/ 14764
(22) Internationales Anmeldedatum:
27. Dezember2002 (27.12.2002)
(25) Einreichungssprache:
(26) VerOffentlichungssprache:
Dcutsch
Deutsch
(30) Angaben zur Prior itat:
101 64 578.3 31. Dezember 2001 (31.12.2001) DE
(71) An m elder (fiir alle Bestimmungsstaaten mil Aus-
nahme von US): INSTITUT F<JR PHYSIKALISCHE
HOCHTECHNOLOGIE E.V. IDE/DE]; Winzerlaer Sir.
10, 07745 Jena (DE).
(71) Anmelder und
(72) Erfinder: LASSNER, Dirk [DE/DEJ; Brockhausstr. 27,
04229 Leipzig (DE). UHLIG, Holm [DE/DE]; Schkeu-
ditzer Sir. 1, 04509 Delitzsch (DE).
(72) Erfinder; und
(75) Erfinder/Anmelder (nur JUr US): KOHLER, Johann,
Michael [DE/DE] ; Untergasse 8, 07751 Golmsdorf (DE).
MAYER, Gunter fDE/DEl; Fritz-Reuter Str. 16, 07745
Jena (DE).
(74) An wait: BOCK, Gerhard; Patentanwaltsbiiro Pfeifler &
Partner, Winzerlaer Str. 10, 07745 Jena (DE).
(81) Bestimmungsstaaten (national): AU, JP, US.
(84) Bestimmungsstaaten (regional): europaisches Patent (AT,
BE, CH, CY, DE, DK, ES, EI, ER, GB, GR, IE, IT, LU, MC,
NL, PT, SE, SI, TR).
[Fortsetzung auf der ndchsten Seite]
(54) Title: CELL SORTING SYSTEM FOR TIIE SIZE-BASED SORTING OR SEPARATION OF CELLS SUSPENDED IN A
FLOWING FLUID
(54) Bezeichnung: ZELLSORTIERSYSTEM ZUR GROSSENABHANGIGEN SORTTERUNG ODER SEPARATION VON IN
EINER STROMENDEN FLtTSSIGKEIT SUSPENDIERTEN ZELLEN
<
IT)
(57) Abstract: The invention relates to a cell sorting system Tor sorting or separating cells suspended in a flowing fluid according to
the size thereof. Said cell sorting system comprises at least one chip (10, 40, 42) provided with a base plate (12) which is overflowed
by the fluid and encompasses a plurality of indentations (31, 60, 62, 70, 80).
[Fortsetzung auf der ntichsten Seite]
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WO 03/056330 A2 ' Hl : l IHHII N 11111111:11 i Mill 111 1 1 1 1 1 LI II li 1 1 1 1 ' II li III III: IHIIU1I II IIHII
VerOfTentlicht: Zur Erkldrung der Zweibuchstaben-Codes und der anderen
— ohne international Recherchenbericht und erneut zu Abkurzungen wird auf die Erkldrungen ("Guidance Notes on
verojfentlichen nach Erhalt des Berichts Codes and Abbreviations ") am Anfang jeder reguldren Ausgabe
der PCT-Gazetle verwiesen.
(57) Zusammenfassung: Die Erfindung belrifft Zellsortiersystem zur groBenabhangigen Sortierung oder Separation von in einer
strtfmenden Fltissigkeit suspendierten Zellen. Die Zellsortiersystem zeichnet sich dadurch aus, dass es zumindest einen Chip (10,
40, 42), der eine von der Flussigkeit uberstromte Grundplatte (12) mil einer Vielzahl von Vertiefungen (31, 60, 62, 70, 80) beinhaltet,
umfasst.
WO 03/056330 PCT/EP02/14764
Zellsortiersystem zur groBenabhangigen Sortierung oder Separation von
in einer stromenden Fliissigkeit suspendierten Zellen
Beschreibung
5 ~ — — —
Die Erfindung betriffl Zellsortiersystem zur groBenabhangigen Sortierung
oder Separation von in einer stromenden Fliissigkeit suspendierten Zellen.
Die Erfindung findet Anwendung in der medizinischen Diagnostik, bnmu-
nologie imd Biotechnologie.
10
Es sind einige Techniken bekannt, mit denen nicht in Geweben organi-
sierte Einzelzellen oder aus Geweben isolierte Einzelzellen nach ihrer
GroBe getrennt und analysiert werden konnen. Nachstehend beschrieben
sind Technflcen, die entwickeit wurden, um Zellen nach ihrer funktionel-
15 len Aktivitat und der Produktion von Sekretionsprodukten zu typisieren
und/oder zu sortieren. Weiterhin sind Methoden angefuhrt, biologische
Molekiile und Zellen in hoher Dichte in einem geeigneten Muster auf
Festphasen anzuordneo, was eine Grundlage der nachfolgend auigezeig-
ten Losung darstellt.
20
1. Die Analyse mittels FACS (fluorescence activated cell sorting) erlaubt
die Detektion und Sortierung von Zellen im wesentlichen nach Oberfla-
chenmarkern. Durch die Auswertung der Streulichteigenschaften (Seiten-
und Vorwartstreulicht) lassen sich bestimmte Population nach der GroBe
25 und Oberflachenbeschaflfenheit einteilen. Fur medizinische Fragestellun-
gen werden die Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikorpem versetzt
und die fluoreszenten Zellen von den nicht gefarbten unterschieden. Somit
lasst sich auch eine Sortierung von markerpositiven bzw. ^egativen Zel-
len ermoglichen.
30
Die groBen Zellsorter konnen bis zu 1 • 10 6 Zellen/min sortieren, aber nur
in zwei Gruppen(GefaBe). Fur eine nachfolgende Untersuchung mussen
die ZeHen erst aus der Sortierfliissigkeit pelletiert werden.
35
Durch Beimischung von Latexpartikeln definierter GroBe zur Probe lassen
sich grobeGrosseneinteiliingen der untersuchten Zellen errreichen. Die
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Analyse einer groBen Zellzahl ist mit dieser Technik in geringer Zeit
moglich. (Shapiro 1995).
Durch Einsatz der Mikrosysterntechnik konnten Zellsortier-Gerate auf
5 strukturierten Siliziumchip gebaut werden. Dafiir wurden Mikropumpen
und -ventile in mikrofluidische Kanalsysteme integriert. Diese Mikro-
Zellsorter sind teilweise billiger und benotigen ein viel geringeres Volu-
men an Tragerflussigkeit bei teilweise hoherer Empftadlichkeit. (Fu etal.
1999, Quake and Scherer 2000).
10
Einen Vorteil stellt die Analyse einer groCen Zellzahl in geringer Zeit dar.
Die Sortierung erfolgt nach unterschiedlicher Ruoreszenzfarbung der
Partikel/Zellen oder die Unterscheidung nach GroBe und Oberflachenbe-
schaffenheit. Allerdings ist auch beim Einsatz von groBennormierten La-
15 texpartikeln eine Sortierung nach GroBe nur in groBen Schwankungsbrei-
ten moglich- Die Auftrennung erfolgt maximal in zwei Gruppen und eine
weitere Analyse der Zellen ist nur an anderen Geraten oder Versuchvor-
richtungen moglich.
20 Die FACS-GerSLte sind sehr teuer und somit nicht fur jedes Labor verfug-
bar.
Bei Zellsortierern auf Mikrochipbasis ist der Verbrauch an Tragerflussig-
keit geringer und damit erhalt man auch eine starker konzentrierte Zell-
25 suspension nach dem Sortiervorgang, allerdings ist hierbei wiederum der
Probendurchsatz geringer und Mikropumpen und -ventile stellen immer
kritische Komponenten in Bezug auf Funktionsdauer der Gerate dar. Al-
lerdings tritt hier auch der Vorteil der Mikrosysterntechnik zu Tage: die
leichte Austauschbarkeit der defekten Module.
30
2. Die Analyse von Zellen kann klassischerweise mikroskopisch erfolgen.
Durch Einsatz von Zahlkammem oder Okularen mit eingeatzter Skale
lasst sich eine Einteilung der Zellen nach GroBe durchfiihren. Dabei kon-
nen die Zellen durch eine Ausstrich bzw. nach Zytozentrifugation auf ei-
35 nen Mikroskopieobjekttrager plaziert werden. Ein Laser-Scanning-
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Mikroskop dient hier als geeigaetes Mittel, weil es Zellen finden kann'
und spater auch wiederfinden kann.
Die Mikroskopie gibt oft einen besseren Eindruck uber die Moiphologie
5 der Zellen, aber die Auswertung ist oft limitiert durch niedrige Zellzahlen
und schlechte Wiederfindung auf dem untersuchten Objekttrager.
3. Mit speziellen Membransystemen soil eine Trenmmg von Zellen be-
stimmter GroBe erreicht werden. Aufgrund der PorengroBe in der Mem-
10 bran kommt es zum Austausch von Zellen zwischen zwei Fliissigkeitre-
servoirs, wobei alle Zellen, die groBer als die Pore sind, zuriickgehalten
werden (JP 1992000058485). Einen vergleichbaren Ansatz fiihrten Carl-
son et aL (1997) durch. Sie schufen ein Gftter mit einer PorengroBe von
5 jim und testeten die hydrodynamischen Eigenschaften von Blutzellen in
15 einem Flussigkeitsstronx Zwischen den Poren wurden verschieden lange
Kanale (von 20-110 pm, Querschnitt 5 • 5 jim) plaziert und somit das Pe-
netrationsverhaken der einzelnen Zelltypen anhand der Wanderungsstrek-
ke auf dem Array gemesseiL
20 Der Einsatz von Membransystemen ist fiir das Aufreinigen / Auflconzen-
trieren von Losungen geeignet. Aber die Zellen auf beiden Seiten der
Membran miissen wie bei 1. mit anderen, nachfolgenden Analysetechni-
ken untersucht werden. Zu groBe Zellzahlen oder starke Verunreinigung
der Suspensionen auch mit EiweiBen, verstopfen oder verkleben die
25 Membran. Auch erfblgt bei so dichten Poren gerade bei vitalen Zellen des
Blutsystems eine Kontaktaktivierung bestimmter Zelltypen (Thrombo-
zyten), was einen veranderten Zustand der urspriinglichen Zelle bewiikt
oder auch das Trenngut schadigen kann.
30 4. Fiir eine Vorsortierung von Partikel und Zellen wurden miniaturisierte
Filter entwickelt, die sowohl eine axiale als auch laterale Auftrennung
nach der GroBe ermoglichen. Dafiir wurden auf SihziunirSchichten Poly-
merwiirfel aufgebracht, die dadurch ein Netzwerk mit unterschiedlicher
Fliessarchitektur schufen. Durch Wahl des Abstandes zwischen dem Po-
35 lymersockel konnte ein AusschluB groBerer Partikel im Flussigkeitsstrom
erreicht werden ( He et al. 1999, Wilding and Kricka 1995).
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Problem bei diesem Ansatz ist das geordnete Aufbringen der Trennele-
mente auf das Silizium. Silizium selbst lasst sich gut strukturieren. Aller-
dings lassen sich mit dieser Methode geringere Erhebungen und auch Po-
5 lymerporen herstellen (in NanometergroBe), was konventionelle Atztech-
niken nicht zulassen.
5. Durch Anlegen von elektrischen Feldern konnen Zellen z. B. nach ihrer
GroBe separiert werden. Grundiiberlegung ist die negative Ladung von
10 Zellen im Fliissigkeitsstrom, was durch pH-Variationen des umgebenden
Mediums modifiziert werden kann (Li and Harrison 1997, Fiedler et al.
1998). Es wurden in Glas Kanale mit einer Tiefe von 15 fxm oder 30 p,m
geatzt oder mit Laser eingebrannt, die ein Sortieren der Zellen in einen
rechtwinklig abzweigenden Kanal durch Anlegen eines elektrischen Fel-
15 des eimoglichen sollen.
Das Sortieren mit elektrischen Feldem ist elegant, aber nicht fur hohen
Probendurchsatz geeignet, da auch hier fur die Trenntmg von zwei be-
nachbarten Zellen ein gewisser Mindestabstand und eine gute elektro-
20 optische Kontrolle notig ist
6. Partikel oder Zellen werden in einem Fliissigkeitsstrom durch verschie-
den breite Kanale geleitet Die GroBe der Kanale nimmt ab und verhindert
ein AbflieBen der entsprechend groBeren Partikel. Die untersuchte Sus-
25 pension wird von den kleineren Partikeln abgereichert. Am SchluB ver-
bleiben die groBten Partikel im Fliissigkeitsstrom (Ball and Fincher 1978).
Eine Sortierung im Fliissigkeitsstroms durch Reduktion der Kapillarbreite
beinhaltet immer die Gefehr der Verstopfimg, was auch bei normalem
30 FluB in Kapillaren haufig geschieht. Die Zellen, welche mit dieser Tech-
nik aussortiert werden, miissen nachfolgend durch andere Techniken un-
tersucht werden.
7. Arraysysteme werden zunehmend genutzt, urn mittels miniaturisierter,
35 definierter Anordnung von definierten Molekulen oder auch Zellen mittels
Hochdurchsatzverfahren zu analysieren. Zellspotarrays sind zur Messung
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von DNA-Expression beschrieben worden (Ziauddia und Sabatini 2001),
allerdings nicht fur die Einzelzellanalyse und nicht fur die Detektion von
Zellsekretionsprodukten an lebenden Zellen. Mikrostnakturierte Oberfla-
chen anderer Autoren zur Positionierung von Zellen mittels Beschichtung
5 von Zelladhasionsmolekulen auf Festphasen erlauben eine Positionierung
von Zellen, allerdings nicht in dem nachfclgend dargestellten Prazisions-
muster (Chen et al. 1998) und unterscheiden sich von dem im folgenden
dargestellten Prinzip der Sortierung grundlegend.
10 Aufgrund der bestehenden Systeme ist eine Anordnung von Einzelzellen
in einem festgelegten Muster und der Nachweis der Sekretionsprodukte
dieser Zellen moglich, aber bisher nicht beschrieben worden. Eine struk-
turierte Anordnung von Einzelzellen mittels Spotautomaten ist zwar prin-
zipiell denkbar, allerdings sehr aufwendig und beim Einsatz von lebenden
15 Zellen im Routinelabor sehr kostenintensiv. Dabei werden die Zellen oft
physisch verletzt oder zerstort Weiterhin basiert das Mikroarray-Prinzip
in dem Aufbringen von Flussigkeitstropfen auf eine feste Oberflache. Die-
se Menge ist nicht beliebig reduzierbar (mindestens 100 nl) und somit ist
das Spotten von Einzelzellen eher als Zufall zu betrachten.
20
8. Es gibt vielfaWge Anwendungen zur Analyse von fliissigen Proben
durch Kapillarsysteme. In manchen wurde eine Vielzahl von Kapillaren
mit verschiedenen Zu- und Ablaufen zur schnellen Analyse von Nuklein-
saure-haltigen Proben (Liu 2001) geschaffenu Dadurch sind auch mehr-
25 stufige Prozesse der Probenbehandlung moglich.
Andere Autoren schufen Mikrokapillaren zur Bestimmung der Beweg-
lichkeit von Spermien (BCricka and Wilding 1995). Im ersten Fall wurde
ein aktiver Transport des zu untersuchenden Materials (DNA, RNA)
30 durch ein sehr enges Kapillarsystem realisiert, im zweiten Fall wurde die
Eigenbeweglichkeit der biologischen Probe (Spermien) ausgetestet, indem
nach einer gewissen Wegstrecke ein Auf&ngbereich eingebaut wurde.
Man unterscheidet aktive und passive Trennverfahren in Mikrokapillaren.
35 Fur aktive Verfahren mit mehreren verschiedenen Schritten wurden, bis
auf die in Punkten 1-7 genannten, keine Analyse von Zellen beschrieben.
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Fur das passive Verfahren, das zu untersuchende Agenz bewegt sich
selbst in der Fliissigkeit, sind nur gewissen Zellen oder biologische Sy-
steme (Spermien, Mikroorganismen, Viren) in der Lage. Diese mussen bei
der Untersuchung auch noch vital sein und somit sind diese Methoden auf
5 einige spezielle Anwendungen limitiert.
Ursachen der Nachteile:
Die Nachteile der verschiedenen Systeme ergeben sich einerseits aus der
Notwendigkeit, die Zellen nach ihrer Grofie oder anderen Markern zu er-
10 kennen und zu trennert Bei Punkt 2 ubernimmt diese Funktion das Auge
oder als Ersatz die Optik wie in Punkt 1.
Die Sortierung der Zellen im Flussigkeitstrom beinhaltet den standig un-
gehinderten FluB der Suspension und die geeignete Trennmethode (Punkte
15 3-6). Nach der Trennung verbleibt die Zelle mit oftmals vielen anderen
wiederum in einer Suspension, und somit sind Einzelaussagen zu den
Zellen nicht sofort moglich (Punkte 1, 3-6).
Die Schwierigkeit, lebende Einzelzellen mittels Blottechniken auf Ober-
20 flachen anzuordnen liegt in der komplizierten technischen Losung des
Spotvorganges, der aus Zelldetektion und eigentlichem Spotvorgang mit-
tels Hochprazisionsmechanik bestehen muB (Punkt 7). Oft ist die Wie-
derfindung nicht gegeben (Punkte 2,3,7), oder ein High-Throughput-
Screening nicht moglich.
25
Bei der Nutzung eines Kapillarnetzwerkes ziir stufenweisen Analyse von
Partikeln oder Zellen stort die bestehende Beweglichkeit der zu untersu-
chenden Objekte. Somit muB eine sequentielle Behandlung von Zellen
entweder mit einem gewissen Mindestabstand der Zellen untereinander
30 erfolgen oder alle gleichennaBen im Pool. Diese Technologie eignet sich
nicht fiir groBe Populationen (uber 10.000 Zellen) oder lasst keine Aussa-
gen zu den einzelnen Zelltypen zu Weiterhin bedeuten viele Kapillaren
immer ein hohes Risiko fiir Verstopfung oder bei sequentiellen Behand-
lung ein Problem der Reinigung/Spulung, urn Reste oder kontaminierende
35 Fliissigkeiten eflSzient zu beseitigen (Punkt 8).
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Ziel vorliegender Erfindung ist, die physische Trennung von Zellen ent-
sprechend ihrer GroBe in einem zur spateren Analyse nach molekularen
Matkern (Proteine, Nukleinsauren) geeignetem System.
5 Es muB eine Festphase geschaffen werden, an welcher eine relativ selb-
standige Ablagerung und definierte Anordnung von Zellen erfolgt, die ei-
ne relativ einfache Einbringung der Proben und aller Reaktionsfliissigkei-
tenzulaBt.
10 Die Aufgabe wird durch den Zellsortiersystem zur groBenabhangigen
Sortienmg oder Separation von in einer stromenden Fltissigkeit suspen-
dierten Zellen mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen gelost
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass das Zellsortiersystem
is zumindest einen Chip, der eine von der Fltissigkeit uberstromte Grund-
platte mit einer Vielzahl von Vertiefimgen beinhaltet, umfasst. Die
Grundplatte besteht vorzugsweise zumindest teilweise aus Silizium, Glas
oder Kunststoff. Die Anordnung der Zellen in den Vertiefimgen erfolgt
durch Sedimentation aufgrund der Graviditat und Scheikrafte im Flussig-
20 keitsstrom, kann aber auch durch andere EElfemittel wie Magnetbeads,
Anlegen eines elektrischen Feldes oder durch optische Manipulationen
(z.B. optische Pinzetten) erifolgen. Die Zellen positionieren sich in den
entsprechenden Zonen auf der Grundplatte derart, dass sich in einer Mi-
krokavitat bestimmter GroBe Zellen mit einer geringeren bis maximal
25 gleichen GroBe positionieren konnen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist eine die Grundplatte
bedeckende Glasplatte des Chips vorgesehen, so dass eine spatere Aus-
wertung der Zellsortierung, beispielsweise durch Fluoreszenzmikrosko-
30 pie, besonders einfech erfolgen kann. Ein Abstand zwischen einer Ober-
kante der Vertiefimgen und der Glasplatte betragt vorzugsweise 10 jun
bis 500 jinx Hierdurch konnen Turbolenzen im Flussigkeitsstrom verhin-
dert werden.
35 Ferner ist bevorzugt, dass mehrere Chips fluidisch miteinander verbunden
sind. Derartige modulare Systeme erlauben eine einfeche und schnelle
0
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Anpassung des Zellsortiersystems an veranderte Einsatzbedingungen. Die
Adaption kann durch Weg-/Aufiiahme oder Ersatz einzelner oder mehre-
rer Chips und/oder Anderung eines Schaltbild der verbundenen Chips er-
folgen.
5
Weiterhin ist bevorzugt, dass eine GroBe der Vertiefungen so vorgegeben
ist, dass sie kugelfiinnige Partikel mit einem Durchmesser von 1 bis 100
pm, insbesondere 5 bis 28 nm, aufiiehmen konnen. Die Durchmesser ent-
sprechen den typischen Abmessungen biologischer Mikrosysteme. Mi-
10 kropartikel mit kleineren Abmessungen werden in der Regel schon durch
Adhasion auf der gesamten Oberflache der Grundplatte gebunden. GroBe-
re Objekte erfordern bereits zu groBe Fluidstrome fiir den Transport, wo-
bei die Gefehr der Bildung von Turbolenzen zunimmt, die eine geordnete
Anordnung der Objekte in den Vertiefungen behindert.
15
Bevorzugt ist ferner, dass Vertiefungen unterschiedlicher GroBe vorhan-
den sind, die insbesondere in Stromungsrichtung der Flussigkeit mit an-
steigender GroBe angeordnet sind. Auf diese Weise lassen sich Fehlbele-
gungen der Vertiefungen mit zu kleinen Objekten gezielt vermeiden. Gtin-
20 stig ist es dabei, wenn die Vertiefongen gieicher GroBe jeweils in einem
gemeinsamen Feld auf einer Grundplatte angeordnet sind. Eine Dichte der
Vertiefungen liegt vorzugsweise im Bereich von 10.000 bis 1.000.000 pro
cm 2 , insbesondere 33.000 bis 440.000 pro cm 2 . Mit den genannten MaB-
nahmen lassen sich in kurzer Zeit sehr groBe Mengen an Zellen auftren-
25 nen und in separat einer Analytik zugangjichen Bereichen binden.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung zeichnet
sich das Zellsortiersystem dadurch aus, dass ein Zuleitungssystem zur
gleichfiirmigen Beflutung der strukturierten Flachen Flussigkeit, dessen
30 Zu- und/oder Ablaufkanale sich insbesondere deltafiirmig aufweitra, vor-
handen ist. Hierdurch werden Verwirbelungen vermieden und somit ein
homogener Fluss der Zellen uber die gesamte Feldbreite erreicht
Bevorzugt ist weiterhin, dass die Vertiefungen in Mustern auf der Grund-
35 platte angeordnet sind, die ein Uberrollen des Feldes auf den Stegen zwi-
schen zwei benachbarten Vertiefungen verhindert. Dies kann insbesonde-
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re dadurch erfolgen, dass die Vertiefungen in Str6mung$richtung zueinan-
der versetzt angeordnet sind. Diese MaBnahme unterstutzt die Sortierung
der Zellen und tragt zur Erhohung der Beladungsdichte der Vertiefiingen
mit den Zellen bei.
5
Gemafi vorliegender Erfindung werden auf Silizium-, Kunststoff- oder
Glasoberflachen mittels Atztechniken bintereinander liegende Zonen mit
gleichmaBig verteilten Vertiefungen definierter, aber unterschiedlicher
GroBe aufgebracbt Die netzartig verteilten Vertiefungen dienen zur
10 strukturierten Anordnung von Einzelzellen und erleichtern dadurch eine
Wiederfindung bei der abschliefienden Analyse. Bei gekammer-
ten/gedeckelten Systemen wird die zu untersuchende Zellsuspension
durch Mikrofliiidikanschlusse und -zuleitungen an die strukturierten
Oberflachen herangefiihrt.
15
Die Vorteile der vorliegenden Losung lassen sich wie folgt zusammenfes-
sen:
1. Simultane Anordnung von Zellen in einer erhdhten Zelldichte (bis zu 1
20 Million Zellen/cm 2 ) gegenuber konventionellen Zytospotverfehren.
2. GroBenabhangige Anordnung von sehr vielen Zellen (bis zu 1 Million)
als Einzelzellen und damit Sortierung groBer Zellpopulationen in be-
stimmte Zelltypen wird moglich.
25
3. Geordnete Irnmobilisierung von Zellen wird moglich und damit auch
eine hohe Wiederfindungsrate durch optische Verfehren (z.B. Mikrosko-
pie/Laseiscaimirg~Mikroskopie) nach verschiedenartiger Behandlung
(Sptil- und Waschschritte, thermische Behandlung bei PCR und Hybridi-
30 sierungstechniken).
4. Durch die raumliche Separation der Einzelzellen konnen lokal ge-
trennte Untersuchungen sehr vieler verschiedener Zellen (Lyrtphozyten,
Makrophagen, zirkulierende Tumorzellen, Zelllinien) durchgefuhrt wer-
35 den.
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5. Zeitabhangige Prozesse konnen sequenziell an einer und derselben
Zelle durchgefuhrt und analysiert werden (Echtzeitanalyse).
6. Die hohe Zellzahl bei der Analyse auf dem Chip erlaubt eine gute stati-
5 stische Auswertung der untersuchten Zellpopulation (Auswertung von
einer Million Zellen nach molekularen Markern (Oberflachenproteine,
Nukleinsauren, auch in Kombination und nach mehreren) und GroBe).
7. Unterstiitzung des Sortierprozesses im Flussigkeitsstrom durch vielfal-
10 tige andere Methoden (Latexpartikel, Magnetbeads, optische Pinzetten)
ist machbar.
8. Untersuchung und Sortierung von lebenden und fixierten Zellen mit
dem Chip ist moglich.
15
9. Die Analyse der immobilisierten Zellen ist durch Imraunophanoiypisie-
rung bzw. durch in situ-Detektion (PCR, Hybridisierung) oder durch
Kombination beider Techniken moglich.
20 Die Vorgehensweise bei der Zellsortierung und nachfolgenden Analytik
kann wie folgt ablaufen:
1 . Die Zellen mussen in einer Suspension au%enommen werden.
25 2. Die Zellen werden nativ benutzt oder einer Vorbehandlung (z.B. Fixie-
rung, Bindung eines Antikorpers) unterzogen.
3. Durch die entsprechenden Mikrofluidikanschlusse werden die Zellen in
den gekammerten Chip gespiilt Die Einspulung der Zellen kann z.B.
30 durch eine Mikroliterspritze manuell oder unter HBlfe einer Dosieqpumpe
erfolgen.
4. Die Anordnung der Zellen erfolgt durch Sedimentation aufgrund der
Graviditat und Sch^krafte im Flussigkeitsstrom, kann aber auch durch
35 andere Hilfemittel wie Magnetbeads, Anlegen eines elektrischen Feldes
oder durch optische Manipulationen (z.B. optische Pinzetten) erfolgen
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bzw. unterstutzt werden. Die Zellen positionieren sich in den entspre-
chenden Zonen auf dem Chip derart, dafi sich in einer Vertiefung be-
stimmter GroBe Zellen mit einer geringeren bis maximal gleichen GroBe
positionieren konnen.
5
5. Die Zellen werden mit verschiedenen Fixanzien gespult und an der
Stelle ihrer Ablagerung fixiert. Die lokale Anbindung der Zellen kann
auch durch eine vorherige Beschichtung der Chipoberflache verstarkt oder
erreicht werden.
10
6. Der gesamte Kammerinhalt wird mehrfach mit Waschlosungen gespiilt,
urn Fixantienreste und unfixierte Zellen abzuspiileiL Nach diesem Sortier-
schritt sind folgende Behandlungen zur Untersuchung der Zellen moglich:
is 7. Der Chip wird mit Reagenzlosungen (z.B. Losung fiir PCR oder Hybri-
disierung) geflillt und die Fluididanschlusse mit Schlauchklemmen ver-
schlossen.
8. Der gesamte Chip mit den immobilisierten Zellen kann dann einer
20 thermischen Behandlung (bis zu 95°C) wie z.B. bei einer Polymerase-
Kettenreaktion (engl. PCR) oder einer Hybridisierung unterzogen werden.
9. Die Reaktionslosung wird durch Spulen mit verschiedenen Waschlo-
sungen entfernt
25
10. Der Chip kann nach veschiedenen Fluoreszenzen (griin z.B. FTTC, rot
z.B. Texas Rot, blau z.B. DAPI, weiB z.B. Fotolumineszenz) gescannt
werden. Ein Laser-Scanning-Mikroskop ist gesonders geeignet, da dieses
MeBverfahren eine hohe Analyserate mit einer hohen Wiederfindungsrate
30 fiir die immobilisierten Zellen besitzt
11. Der Scanvorgang kann auch zwischendurch nach verschiedenen ande-
ren Waschvorgangen oder Behandlungen durchgefuhrt oder wiederholt
werden.
35
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Die Erfindung betrifft demnach ein Zellsortiersystem zur Vereinzelung
von Partikeln/Zellen aus groBen Populationen und Sortierung nach GroBe
an mikrostnikturierten Festphasen.
5 Dabei werden zur eflFektrven Separierung und Anordnung von Parti-
keln/Zellen oder Mikroorganismen lebende oder behandelte Einzelzellen
oder andere Partikel aus groBen Populationen an strnkturierten Festphasen
(Silizium, Glas, Plastik) nach einem vorgegebenen Muster in Vertiefungen
mit bestimmter GroBe vereinzelt
10
Die Auftrennung der Partikel oder Zellen erfolgt durch Sedimentation
nach der Graviditat und Scherkraften aus einem Fliissigkeitsstrom heraus,
ohne weitere Hilfemittel, kann aber durch Anlegen eines magnetischen
oder elektrischen Feldes bzw. durch Licht (z.B. optische Pinzetten) ver-
15 starkt werden.
Das Zellsortiersystem ist zur simultanen Auftrennung sehr groBer Popula-
tionen (z.B. 1 Million Zellen) in kurzer Zeit 1-10 min nach der GroBe fur
eine nachfolgende Analyse als Einzelspots geeignet
20
Das Zellsortiersystem dient zur simultanen Anordnung sehr groBer Zell-
populationen fiir eine hohe Wiederfindungsrate bei sequentiellen Analy-
ses Durch die Auswertung wird eine hohe statistische Genauigkeit der
untersuchten Probe erreicht.
25
Die Separation kann in gekammerten (gedeckelten) Vorrichtungen mit
Mikrofluidikanschliissen oder auch in geoflfiieten Systemen, mit ober-
flachlichemFlussigkeitsstroiii, erfolgen.
30 Durch Analyse des Separationsergebnisses (z.B. durch Mikroskopie)
konnen die Beladung der Kavitaten mit Einzelzellen von Doppelbeladun-
gen (zwei oder mehr Partikel) unterschieden werden.
Bei Verwendung geeigneter Materialien konnen mit den separierten Zel-
35 len oder Partikeln themiische Reaktionen durchgefuhrt weiden (Silizium
bis ca. 450°C).
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- 13-
Die Analyse der angeordneten Partikel/Zellen erlaubt lokal getrennte (Ab-
stand zwischen zwei Spots ab 5 ^m) Untersuchungen nach molekularen
Markern, wie genetischem Material (DNAJRNA) oder zellularen Eiwei-
5 Ben. Aber auch physikalisch-chemische Untersuchungen wie Chemikali-
enresistenz, Einfluss von Licht (UV, Rontgenstrahlen), Temperatur oder
Druck (Luftdruck) konnen durchgefuhrt werden.
Nachfolgend wird die Erfindung in zwei Ausfuhrungsbeispielen und an-
10 hand der Zeichnungen naher erlautert Es zeigen:
Figur 1 ein Zellsortiersystem nach einer ersten Variante,
»
Figur la fiinf Ausschnitte A-E aus einem Zellsortiersystem gemafl Fi-
is gurl,
Figur 2 ein Zellsortiersystem nach einer weiteren Variante,
Figur 3 eine schematische Darstellung der Zellsortierung und
20
Figur 4 beispielhafte Untersuchung einer sortierten Zelle in einer Mi-
krokavitat.
Figur 1 zeigt in einer schematischen E>q>losionsdarstellung ein Zellsortier-
25 system, das einen Chip 10 umfasst Der Chip 10 gemaB Figur 1 besteht
aus einer Sili2iumgrundplatte 12, auf welche durch anodisches Bonden
eine Glasplatte 14 aufgebracht wurde, und somit ein gekammertes System
entsteht
30 Die Grundplatte 12 kann sowohl durch Atztechniken als auch durch Ab-
formtechniken erzeugt werden. Als Material kommen Silizium, Glas oder
auch Plastik in Betracht Zur Herstellung von gekammerten Systemen er-
folgt Bonden oder Verldeben bei PlastikwerkstoflFen der Ober- und Un-
terplatte 12, 14.
35
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Gekammerte Chips 10 sind fur den gewollten Siebeffekt uber den Mikro-
kavitaten bestimmter GroBe besser geeignet als oflfene Systeme.
Die Glasplatte 14 sollte aus optischem Glas sein, damit eine spatere Aus-
5 wertung der Zellsortierung durch Fluoreszenzmikroskopie erfolgen kann.
In die Siliziumplatte sind vier Felder 16, 18, 20, 22 mit je einem deltaMhn-
lichen Zuleitungssystem 24 als Zu- und Ablauf von Flussigjceiten geatzt.
10 Das flussigkeitzufiihrende Delta besteht im Beispiel aus Kanalen mit einer
einheitlichen Atztiefe von 60 jxm und einer Verzweigungsrate von 2 6 , d.h.
1 beginnender Kanal auf endgCiltig 128 Kanale. Grundprinzip ist die
gleichformige Beflutung der strukturierten Flachen, urn Venvirbelungen
zu vermeiden und somit einen homogenen FluB der Zellen/Partikel uber
is die gesamte Feldbreite zu erreichen.
Das abflieBende Delta beginnt spiegelsymmetrisch mit 128 Kanalen und
verjungt sich auf 1 Kanal. Am Anfang und Ende des jeweiligen Einzelka-
nals ist ein MikrofluidikanschluB 28, 30 eingeklebt, welcher durch ein
20 Loch in der abdeckenden Glasplatte 14 die Zufuhrung von Fliissigkeiten
zu den deltafi>nnigen Kapillarsystemen erm5glicht
Zwischen den beiden Deltas befinden sich die vier Felder 16, 18, 20, 22
mit einer unterschiedlichen Anzahl an geatzten Vertiefungen unterschied-
25 licher GroBe. Auf dem ersten Feld 16 befindet sich ein Array mit einer
Atztiefe, die kugelfbrmige Partikel mit einem Durchmesser von 5 [im auf-
nehmen kann (Dichte 440.000/cm 2 ). Das zweite, dritte und vierte Feld 18,
20, 22 enthalt analog Vertiefungen mit nachfolgend aufgefuhrter GroBe
und Dichte: 10 ^m, Dichte 190.000/cm 2 , 16 jim, Dichte 92.000/cna 2 ,
30 28 jim, Dichte 33.000 /cm 2 .
Die Anordnung der Felder 16, 18, 20, 22 erfolgt in anwachsender GroBe
der Vertiefimgen (von 5 bis 28 jxm). Der prozentuale Anteil von Vertie-
fungen in Feld 16, 18, 20, und 22 sollte sich wie 10%, 30%, 50% und
35 10% verhalten. Diese Aufteilung resultiert aus dem Bestreben mit diesem
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Chip 10 auch Untersuchungen der Zellen aus Vollblut durchzufiihren.
Hierdurch ergibt sich folgende Aufteilung (siehe Tabelle 1).
Zur Verdeutlichung des Aufbaus des Chips 10 sind der Figur la fiinf ver-
5 groBerte Ausschnitte A-E zu entnehmen.
Ausschnitt A zeigt Zulaufkanale 25 des Zuleitungssystems 24 mit in Fliis-
sigkeit eingebundenen Luftblasen 27.
10 Ausschnitt B zeigt Ablaufkanale 29 des Zuleitungssystems 24 mit netz-
foimig angeordneten Vertiefungen 3 1 .
Ausschnitt C ist eine Darstellung des anisotropen Atzens in den netzfor-
mig angeordneten Vertiefungen 3 1 .
15
Die Ausschnitte D und E zeigen jeweils den Ubergangsbereich zwischen
den Feldern 20, 22 bzw. 16, 18, die Vertiefungen verschiedener Gr6fie
beinhalten.
20 Das ZeUsortiersystem gemaB Figur 2 besteht aus zwei in Reihe geschal-
teten Chips 40, 42, gleicht aber sonst im Aufbau dem des vorhergehenden
Ausfuhrungsbeispiels. Die Chips 40, 42 beinhalten zwei Felder 44, 46
auf. Allerdings sind die Felder 44, 46 mit den unterschiedlich grofien Ka-
vitaten nicht nacheinander in einem Kammersystem angeordnet. Zu jedem
25 Feld 44, 46 fuhrt ein eigenes deltaahnliches Zuleitungssystem 48, 50 als
Zu- und Ablauf von Fliissigkeiten. Zwei Felder 44, 46 werden durch einen
Schlauch verbunden, wobei wiederum die Zellsuspension erst tiber das
Feld 44 mit den kleineren Kavitaten flieBt und dann erst auf das Feld 46
mit den groBeren Vertiefungen. Diese Anordnung lasst sich auf beliebig
30 viele Felder erweitern.
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Tabelle 1 : Gr66e der Kavitaten auf den Feldem des Chips 10
und entsprechende ZellgroBen mit prozentualer Verteilung im Blut
Feld-
Nr.
GrdBe der Zel-
len, welche in
die Kavitat pas-
sen
Zelltypen/Bestandteile
insbesondere aus Vollblut
Mittlerer theorem
scher
Prozentsatz (in %)
1
bis 5 Jim
Thrombozyten
Mycoplasmen, Viren, Myofi-
broblasten
10
2
bis 10[im
Lymphozyten, Erythrozyten*
30
3
bis 16jim
Granulozyten, Fibroblasten
Plasmazellen
50
4
bis 28 nm
Monozyten, Hepatozyten,
Spermien, Granulozyten
10
5 * Erythrozyten sollten nach vorangegangener Lyse des Vollblutes nicht
mehr vorhanden sein-
Die Erfindung soil nachstehend anhand von detaillierten Ausfuhrungsbei-
spielen naher erlautert werden.
10
Der Testablauf wird am Chip 10 folgendermaBen durchgefuhit:
Aus einer 2,8-ml Monovette wurden 2ml-EDTA-Vollblut entnommen und
die Eiythrozytenlyse mit der 4-fachen Menge eiskaltem Lysepuflfer in Eis
is durchgefiihrt Nach Zentrifugation und 3fachen Waschschritten wurde das
Pellet (weiBe Blutzellen) in PBS-Puflfer resuspendiert. Die roten Blutkor-
perchen (Eiythrozyten) sollten nicht, oder nur noch in vernachlassigbar
geringer Menge im Ansatz vorhanden seiiL
20 Fur eine anschlieftende Behandlung der Zellen wurden diese mit Permea-
Fix (Qrtho Diagnostics, Neckargmiind) fixiert und bis zur endgiiltigen
Verwendung in PBS-Puffer bei 4°C aufbewahrt
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-17-
Vor dem Auftragen auf den Chip 10 wurden die Zellen mit Fluoreszenz-
farbstoffen inkubiert. Propidiumjodid als Kernforbstoff bewirkt eine Rot-
fluoreszenz der Zellen, bei gleichzeitiger Griinfluoreszenz. DAPI bewirkt
als Kernferbstoff eine violett-blaue Fluoreszenz der Zellen und zeigt keine
5 Griinfluoreszenz.
Die Zellen wurde mit je einem Farbstoff (DAPI oder Propidiumjodid)
gefarbt und dann mit griin-gelb fluoreszierenden Latex-Kugeln (4,9 pm
Durchmesser) versetzt.
10
Der gekammerte Chip 10 wurde mit 1 ml PBS-Puffer gefiillt und gespiilt.
Dafur wurde eine Hamilton-Glasspritze verwendet
Eine vorherige Spiilung des gekammerten Chips 10 mit einer Proteinlo-
15 sung (z.B. Protein A) ist moglich, welches sich an die Siliziumoberflachen
bindet und eine bessere Anhaftung von Zellen oder spater benotigten An-
tikorper bewirkt.
Das Zellsortiersystem wurde dann mit einer Zellsuspension von etwa
20 2xl0 6 Zellen pro 1000 pi gefullt Fiir die eigentliche Beschichtung sind
100-200 jxl ausreichend. Die Suspension muB mit einer Flussrate von
max. 100-400 jil/min eingespritzt werden, damit eine geordnete Ablage-
rung der Zellen erfolgen kann.
25 Die Anordnung der Zellen erfolgt durch die Graviditat im Flussigkeits-
strom. Die Zellen 50, 52, 54 positionieren sich entsprechend ihrer GroBe
in die vorbereiteten Vertiefimgen 60, 62 ahnlicher GroBe (Figur 3). Die
groBeren Zellen 54 oder Partikel rollen fiber die kleineren Vertieftmgen
60, 62 bis zu dem Feld mit den entsprechenden Vertiefungen (hier nicht
30 dargestellt). Deshalb mussen in FluBrichtung erst die kleinen Kavitaten
60, 62 vorgesehen sein, damit sich die kleinen Partikel 50, 52 als erstes
ablagern, und nur die groBeren Partikel 54 im Flussigkeitsstrom verblei-
ben.
35 Die Zellsuspension darf bei diesem Chip 10 nicht mehr als 300.000 Zel-
len von einem GroBenbereich (siehe Tabelle 1), insgesamt unter 1 Mio.
WO 03/056330 PCT/EP02/1 4764
-18-
Zellen, enthalten, da sonst zwangsmaBig kleinere Zellen in den nachsten
Bereich gespiilt werden und sich dort ablagern.
Ziel ist das Erreichen einer moglichst hohen Dichte an Zellen aus dem
5 gleichen GroBenbereich, wobei eine moglichst hohe Zahl von Mikrover-
tiefimgen mit nur einer Zelle gefiillt sein sollert Erreicht wird diese Zell-
dichte durch eine moglichst dichte Anordnung der Mikrokavitaten Ver-
starkt wird dieser EfFekt durch die Anordnung der Mikrokavitaten in spe-
ziellen, z.T. versetzten Mustern selbst, dadurch soli ein Uberrollen des
10 Sortierfeldes auf den Stegen zwischen zwei benachbarten Kavitaten ver-
hindert werden.
Eine Vorbehandlung der Siliziumoberflache fiihrt zu veranderten Eigen-
schaften (Ladung, Hydrophobizitat) der Oberflache.
15 Das Anlegen eines Magnetfeldes oder Einsatz optischer Verfahren kann
das Festhalten oder Plazieren der Zellen in den Vertiefungen sichem oder
unterstiitzen.
Die endgiiltige Trermung der Zellen entsprechend ihrer GroBe erfolgt
20 durch die nachfolgenden Waschschritte. Nicht in den Vertiefungen posi-
tionierte Zellen werden nach Anlegen eines geeignet starken Fliissigjceits-
stromes wieder entfemt. Bei Waschschritten sollte einerseits das Auswa-
schen von in den Vertiefungen befindlichen Zellen durch Wirbelbildung
vermieden werden, andererseits eine Schadigung der Zellen durch einen
25 massiven Flussigkeitsstrom ausgeschlossen sein Stromungsraten von 0,3-
0,01 ml pro Sekunde haben sich als sinnvoll herausgestellt. Von wesentli-
cher Bedeutung fur das Vermeiden von Verwirbelungen und damit dem
Herauswaschen von Zellen ist der Abstand zwischen der Oberkante der
Vertiefiingen und einer mikroskopierfihigen z.B. Quarzglasoberflache.
30 Bei AbstSnden ab 500 ^un treten sehr starke Verwirbelungen air^ bei Ab-
standen unter 10 ^m ist der Flussigkeitsstrom mit Zellen stark beeintrach-
tigt. Mehrfeche, pulsartige Beladungs- und Waschzyklen erhShen die
Dichte und die Effektivitat der Beladung. Die Waschschritte sind eben-
falls in pulsartigen Zyklen effektiv. Waschmengen von insgesamt 1-2 ml
35 sind bei pulsartigem Waschen ausreichend.
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-19-
Bei Auftrennung unfixierter Zellen eihoht eine Anreicherung der
Waschlosung mit Zellkulturmedium oder EiweiB (Albumin 0,1-1%) die
Vitalitat der Zellen wahrend der anschliefienden Tests.
5 Mikroskopiervorgang des Zell-Arrays nach verschiedenen Fluoreszenzen
(griin z.B. FTTC, rot z.B. Texas Rot, blau z.B. DAPI, weiB z.B. Fotolumi-
neszenz). Fur diese Analyse muB immer das Auflichtverfahren genutzt
werden, da die Grundplatte aus Silizium fur das in der Mikroskopie haufig
genutzte I>irchHch1prinzip nicht geeignet ist. Bei Overlay-Darstellungen
10 kann die Zuordnung von zellularer Fluoreszenz zur stoikturierten Siliziu-
moberflache erfolgen. Hierdurch konnen Doppelbeladungen (mehr als
eine Zelle pro Kavitat) ausgeschlossen werden.
Ein I^ser-Scanning-Mikroskop ist dahingehend geeignet, da dieses Mefl-
15 verfahren eine hohe Durchsatzrate mit einer hohen Sensitivitat fur die
Zellmarker besitzt. Andererseits treten innerhalb der Mikrovertiefung eine
Reihe von Reflexions- und Streulichteffekten au£ die zur Auswertung
herangezogen werden konnen und die die Sensitivitat erhohen konnen.
Ein nicht konfokaler Mefimodus ist deshalb sinnvoll, weil ein GraBteil der
20 Vertiefungsoberflache, die zur Messung genutzt werden kann, in der Ver-
tikalen angeordnet ist, damit nahezu nur zu Reflexions- und Streulicht
fuhrt, was bei konfokaler Messung dann nahezu ausgeblendet werden
wiirde. Bei einer 50fachen Mikroskopvergrosserung konnen bei 10 \\m
MikrowellgroBe etwa 14.000 Vertiefimgen gleichzeitig analysiert werden.
25
Nach der groBenbedingten Anordnung der Zellen auf der strukturierten
Siliziumoberflache konnen die Zellen mit traditionellen Nachweismetho-
den untersucht werden.
30 Hat man native Zellen 70 aufgetrennt, kann jetzt eine Inkubation mit
Nahrmedien erfolgen, so daB die Zellen 70 lokal positioniert, eine StofF-
wechselaktivitat entfalten (Figur 4). In ihrem Umfeld oder direkt in ihnen
konnen dann EiweiBe oder andere Sekretionsprodukte 72 detektiert wer-
den. Dies erfolgt im allgemeinen mit spezifischen Antikorpem 74, 76, 78,
35 die beispielsweise gegen die Zelloberflache, gegen Kemproteine oder die
Sekretionsprodukte 72 wirken.
•1
WO 03/056330 PCT/EP02/14764
20
Hierfur konnen die bereits sedimentierten Zellen 70 noch mehrfach gewa-
schen werden, auch urn diese selbst aus den Mikrokavitaten 80 zu entfer-
nen- Somit bleiben nur deren Sekretionsprodukte 72 in den Vertiefungen
5 80 zuriick.
Will man die Zellen direkt nachweisen, kann man durch Sptilen des Chips
mit Fixantien die Anheftung und Stabilitat der Zellen in den Vertiefungen
verstarken.
10
Fur molekularbiologische Untersuchungen konnen die sortierten Zellen
durch verschiedene Techniken untersucht werden. Es konnen alle gangi-
gen Fixierungsschritte durchgefuhrt werden, urn eine anschlieftende In-
situ-Diagnostik durch Hybridisierung spezifischer Gensonden zu ermogli-
15 chen. Aufgrund der guten Warmeleitfahigkeit der Siliziumwafers konnen
auch temperierte Reaktionen, wie bei den Untersuchungen mit der Me-
thoden der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgen. Hierbei mussen
nur die Mikrofluidikanschltisse der Reaktionskammer gut verschlossen
werden, urn eine Verdampfung der Reaktionslosungen zu verhindem. Die
20 Kontaktstellen beim anodischen Bonden des Glases auf Silizium lassen
Temperaturbehandlungen bis 450°C zu, allerdings sind die eingeklebten
Mikrofluidikanschltisse nur bis ca. 100°C stabiL
In einem zweiten Aiisfuhrungsbeispiel wird der Testablauf am Zellsor-
25 tiersystem gemaB Figur 2 folgendermaBen durchgefuhrt:
Aus einer 2,8-ml Monovette wurden 2ml-EDTA-Vollblut entnommen und
die Erythrozytenlyse mit der 4-fachen Menge eiskaltem Lysepuffer in Eis
durchgefuhrt. Nach Zentrifiigation und 3fachen Waschschritten wurde das
30 Pellet (weiBe Blutzellen) in PBS-Puffer resuspendiert Die roten Blutkor-
perchen (Erythrozyten) sollten nicht, oder nur noch in veroachlassigbar
geringer Menge im Ansatz vorhanden sein.
Fur eine anschliefiende Behandlung der Zellen wurden diese mit Permea-
35 Fix (Ortho Diagnostics, Neckargmiind) fixiert und bis endgiiltigen Ver-
wendung in PBS-Puffer bei 4°C aufbewahrt.
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Vor dem Auftragen auf den Chip wurden die Zellen rait Fluoreszenzferb-
stoflfen inkubiert. Propidiumjodid als KernferbstoflF bewirkt eine Rotfluo-
reszenz der Zellen, bewirkt gleichzeitig auch eine Grunfluoreszenz. DAPI
5 bewirkt als Kernfarbstoff eine violett-blaue Fluoreszenz der Zellen und
zeigt keine Grunfluoreszenz.
Die Zellen wurde mit je einem FarbstofF (DAPI oder Propidiumjodid)
gefarbt und dann rait grun-gelb fluoreszierenden Latex-Kugeln (4,9 jim
10 Durchmesser) versetzt.
Zwei einzelne Felder 44, 46 auf dem Siliziumwafer wurden durch einen
Schlauch verbunden und mit 1ml PBS-Pufier gefullt und gespult (Figur 2).
Daflir wurde eine Hamilton-Glasspritze verwendet
15
Eine Zellsuspension von etwa 2x1 0 6 Zellen pro 1000 jxl wurde, begin-
nend mit dem Feld 44 welches die kleineren Kavitaten enthalt, injiziert.
Fur die eigentliche Beschichtung sind 100-200 ^1 ausreichend. Die Sus-
pension muB mit einer FluBrate von max. 100-400 ^il/min eingespritzt
20 werden, damit eine geordnete Ablagerung der Zellen erfolgen kann. Erst
wurde nur die erste Kammer gefullt und dann weiter injiziert, bis auch die
zweite Kammer gefullt war. Die leichte VerzSgerung erhohte die Sedi-
mentation der kleineren Zellen im ersten Sortierfeld.
25 Die weitere Injektion wirkte gleichzeitig als Spiilschritt und bewegte alle
groBeren Zellen auf das zweite Feld 46. Unter dem Mikroskop waren an-
fengs rote Zellen und griine Beads auf Feld 44 zu sehen. Nach der weite-
ren Injektion und einem Waschschritt verschwanden alle rotgeSrbten
Zellen von Feld 44 und es blieben nur grunfluoreszierende Beads zuriick.
30 In Feld 46 fenden sich die roten Zellen wieder und nur ganz vereinzelt
einige Beads, die bei einer besseren Optimierung der Suspensionen (we-
niger Beads im Ansatz) nicht mehr nachweisbar sind.
35
Somit bietet der Chip 10 der Figur 1 ein geschlossenes System fiir die
komplette Auftrennung sehr vieler Zellen in alle GroBengnxppen, aber
aufgrund der raumlichen Nahe der einzelnen Sortierfelder ohne spezielle
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Barriere kommt es zum Ubertritt von kleineren Zellen auf das nachste
Feld.
Beim Zellsortiersystem gemaB Figur 2 verlangert sich der Auftrennungs-
5 weg und die benotigte Menge an Zellsuspension durch die Schlauchver-
bindungen, aber die schrittweise Ihjektion der Zellen, ein Feld nach dem
anderen, erhoht die Auftrennung der einzelnen Zellpopulationen und er~
gibt eine hohere Sortiergenauigkeit. Zusatzlich kann sehr leicht der Sor-
tiermodus festlegt oder variert werden, je nach Verbindung der ge-
10 wunschten Sortierkammera
Durch unterschiedliche Beschichtung von Sortierfeldern mit EiweiBen
oder Antikorpern oder anderen Fangermolekiilen, lassen sich sogar Zellen
gleicher Grolie aufhrennen, was beim Chip 10 schwer machbar ist.
15
Dargestellt wurde ein Ver&hren zur groBenabhangigen Separation von
verschiedenen Zellpopulationen auf einem strukturierten, gekammerten
Festphasenchip (z.B. Silizium-Glas) mit ein mikrofliiidischen Spiilsystem.
Die stnikturierten Festphasen erlauben eine geordnete Anordnung von
20 Zellen entsprechend deren GroBe in einer sehr hohen Dichte (150.000 pro
cm 2 ). Unterstiitzt werden kann die Separation durch Einsatz magnetischer
Beads oder andere physikalische Prinzipien wie lasergesteuerte Auslen-
kung ("optische Pinzetten' ) ) von Zellen. Die Zellen konnen dann ohne und
nach Fixierung mit verschiedenen Methoden z.B. durch Immunophanoty-
25 pisierung mit spezifischen Antikorpern, oder durch In situ-Detektion
durch Hybridisierung mit einer spezifischen Ohgo-Nukleotid-Sonde oder
nach vorangegangener Anplifikation von genetischem Material (DNA,
RNA) mit einer intrazellularen Polymerase-Kettenreaktion naher charak-
terisiert werden.
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Bezugszeichenliste :
10, 40, 42
12
14
16, 18, 20, 22, 44, 46 -
24, 48, 50
25, 29
28, 30
31, 60, 62, 70, 80
Chip
Grundplatte
Platte
Feld
Zuleitungssystem
Kanalen
Mikrofluidanschliisse
Vertiefungen
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Patentanspriiche
1 . Zellsortiersystem zur groBerabhangigen Sortierung oder Separation
von in einer stromenden Fliissigkeit suspendierten Zellen, dadurch
gekennzeichnet, dass das Zellsortiersystem zumindest einen Chip
(10, 40, 42), der eine von der Fliissigkeit ttberstromte Grundplatte
(12) mit einer Vielzahl von Vertiefungen (31, 60, 62, 70, 80) bein-
haltet, umfasst.
2. Zellsortiersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
eine die Grundplatte (12) bedeckende Platte (14) vorhanden ist
3. Zellsortiersystem nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass
ein Abstand zwischen einer Oberkante der Vertiefiingen (31, 60,
62, 70, 80) und der Platte (14) 10 fim bis 500 pm betragt.
4. Zellsortiersystem nach einem oder mehreren der Anspriiche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefungen (31, 60, 62, 70, 80)
in Stromungsrichtung zueinander versetzt angeordnet sind.
5. Zellsortiersystem nach einem oder mehreren der Anspriiche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Chips (10, 40, 42) fluidisch
miteinandcr verbunden sind.
6. Zellsortiersystem nach einem oder mehreren der Anspriiche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, dass eine GroBe der Vertiefungen (31, 60,
62, 70, 80) so vorgegeben ist, dass sie kugelflirmige Partikel mit
einem Durchmesser von 1 bis 100 inn, insbesondere 5 bis 28 jim,
aufhehmen konnen.
7. Zellsortiersystem nach einem oder mehreren der Anspriiche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, dass Vertiefiingen (31, 60, 62, 70, 80)
unterschiedlicher GroBe vorhanden sind.
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8. Zellsortiersystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass
die Vertiefungen (31, 60, 62, 70, 80) mit ansteigender GroBe in
Str6mungsrichtung der Flussigkeit angeordnet sind.
9. Zellsortiersystem nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeich-
net, dass Vertiefimgen (31, 60, 62, 70, 80) gleicher GroBe jeweils
in einem gemeinsamen Feld (16, 18, 20, 22, 44, 46) auf der Grund-
platte (12) angeordnet sind.
10. Zellsortiersystem nach einem oder mehreren der Anspriiche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Dichte der Vertiefungen (31,
60, 62, 70, 80) im Bereich von 10.000 bis 1.000.000 pro cm 2 , ins-
besondere 33.000 bis 440.000 pro cm 2 , liegt
11. Zellsortiersystem nach einem oder mehreren der Anspriiche 1 bis
10, dadurch gekennzeichnet, dass die Grundplatte (12) zumindest
teilweise aus Silizium, Glas oder Kunststoff besteht.
1 2 . Zellsortiersystem nach einem oder mehreren der Anspriiche 1 bis
1 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zuleitungssystem (24, 48, 50)
zur gleichiormigen Beflutung der stnikturierten Flachen mit Flus-
sigkeit vorhanden ist
13. Zellsortiersystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass
sich ein Zu- und/oder Ablauf des Zuleitungssystems (24, 48, 50)
deltafbrmig aufiveitet
14. Zellsortiersystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass
der Zu- und/oder Ablauf aus Kanalen (25, 29) besteht, die sich ver-
zweigenbzw. verjungen.
15. Zellsortiersystem nach einem der Anspriiche 12 bis 14, dadurch
gekennzeichnet, dass das Zuleitungssystem (24, 48, 50) Mikroflui-
danschliisse (28, 30) umfesst.
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-26-
1 6 . ZeUsortiersystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass
die Vertiefungen (31, 60, 62, 70, 80) in Musteni auf der Grund-
platte (12) angeordnet sind, die ein Uberrollen des Feldes (16, 18,
20, 22, 44, 46) auf den Stegen zwischen zwei benachbarten Ver-
5 tiefungen (31, 60, 62, 70, 80) verhindert.
17. Zellsortiersystem nach einem oder mehreren der Anspruche 1 bis
16, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Festhalten oder Plat-
zieren von Zellen in den Vertiefungen (31, 60, 62, 70, 80) vorhan-
10 den sind.
18. ZeUsortiersystem nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass
die Grundplatte (12) aus Silizium ist und die Siliziumoberflache mit
einer Proteinlosung beschichtet ist.
15
19. Zellsortiersystemnach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass
die Grundplatte (12) aus Silizium ist und die Siliziumoberflache
derart behandelt ist, dass sich deren Ladung und Hydrophobizitat
geandert hat
20
20. Zellsortiersystem nach den Anspriichen 3, dadurch gekennzeichnet,
dass die Platte (14) lichtdurchlassig ist.
21. ZeUsortiersystem nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass
25 die Platte (14) aus Glas ist.
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1/4
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Fig. 1a
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2/4
Fig. 2
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3/4
Fig. 3
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4/4
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Fig. 4
(12) NACH DEM VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ZU SAM MEN ARBEIT AUF DEM GEB1ET DES
PATENTWESENS (PCT) VERdFFENTLICHTE INTERNATIONALE ANMELDUNG
(19) Weltorganisation fur geistiges Eigentum
Internationales Buro
(43) Internationales Veroffentlichungsdatum
10. Juli 2003 (10.07.2003)
PCT
(10) Internationale Verttffentlichungsnummer
WO 03/056330 A3
(51) Internationale Patentklassifikation 7 : G01N 33/543,
33/552, B01J 19/00, BOIL 3/00
(21) Internationales Aktenzeichen:
PCT/EP02/14764
(22) Internationales Anmeldedatum:
27. Dczcmber 2002 (27.12.2002)
(25) Einreichungssprache:
(26) Veroffentlichungssprache:
Deutsch
Deutsch
(30) Angaben zur Prioritat:
101 64 578.3 31. Dezember 2001 (31.12.2001) DE
(71) Anmelder (fur alle Bestimmungsstaaten mit Aus-
nahme von US): INSTITUT FOR PHYSIKALISCHE
HOCHTECHNOLOGIE E.V. [DE/DE]; Winzerlaer Str.
10, 07745 Jena (DE).
(71) Anmelder und
(72) ErGnder: LASSNER, Dirk [DE/DE]; Brockhausslr. 27,
04229 Leipzig (DE). UHLIG, Holm [DE/DE]; Schkeu-
ditzer Str. 1, 04509 Delitzsch (DE).
(72) Erfinder; und
(75) Erfinder/Anmelder (nur fur US): KOHLER, Johann,
Michael [DE/DE]; Untergasse 8, 07751 Golmsdorf (DE).
MAYER, Gunter [DE/DE]; Fritz-Reuter Str. 16, 07745
Jena (DE).
(74) Anwatt: BOCK, Gerhard; Bock & Bicbcr, Winzerlaer
Str. 10, 07745 Jena (DE).
(81) Bestimmungsstaaten (national): AU, JP, US.
(84) Bestimm ungsstaaten (regional) : europaisches Patent (AT,
BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC,
NL, PT, SE, SI, TR).
[Fortsetzung auf der ntichsten Seite]
(54) Title: CELL SORTING SYSTEM FOR THE SIZE-BASED SORTING OR SEPARATION OF CELLS SUSPENDED IN A
FLOWING FLUID
(54) Bezeichnung: ZELLSORTIERSYSTEM ZUR GROSSENABHANGIGEN SORI1ERUNG ODER SEPARATION VON IN
EINER STROMENDEN FLUSSIGKETT SUSPENDIERTEN ZELLEN
10
3
I
14
V
16
18
20
22
(57) Abstract: The invention relates to a cell sorting system for sorting or separating cells suspended in a flowing fluid according to
the size thereof. Said cell sorting system comprises at least one chip (10, 40, 42) provided with a base plate (12) which is overflowed
by the fluid and encompasses a plurality of indentations (31, 60, 62, 70, 80).
[Fortsetzung auf der nachsten Seite]
WO 03/056330 A3 I II1E1 imiHI I! fill I II 111 Illll Hill lllll JfHI IIIH 1111 IIIIID llll IIEI All
Veroffentlicht:
— mit internationalem Recherchenbericht
— vor Ablauf der fur Anderungen der Anspruche geltenden
Frist; Veroffentlichung wird wiederholt, falls Anderungen
eintrejfen
(88) Verdffentlichungsdatum des interim tionnlcn
Recherchenberichts: 9. Oktober 2003
Zur Erklarung der Zweibuchstaben-Codes und der anderen Ab-
kurzungen wird auf die Erkltirungen ("Guidance Notes on Co-
des and Abbreviations") am Anfangjeder regularen Ausgabe der
PCT-Gazette verwiesen.
(57) Zusammenfassung: Die Erfindung betrifft Zellsortiersystem zur groBenabhangigen Sortierung oder Separation von in einer
stromenden Fllissigkeit suspendierten Zellen. Die Zellsortiersystem zeichnet sich dadurch aus, dass es zumindest einen Chip (10,
40, 42), der eine von der FlUssigkeit Uberstrflmte Grundplatte (12) mit einer Viclzahl von Vertiefungcn (31, 60, 62, 70, 80) bcinhaltct,
umfasst.
INTRANATIONAL SEARCH REPORT
imemeti^^Appiicatien No
PCT/EP 02/14764
A. CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER
IPC 7 601N33/543 G01N33/552 B01J19/00 B01L3/00
According to International Patenl Classification (IPC) or to both national classification and IPC
a FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)
IPC 7 G01N B01J BOIL
Documentation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are Included In the fields searched
Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practical, search terms used)
EPO-Internal , WPI Data, PAJ, BIOSIS, EMBASE, MEDLINE
C. DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category ° Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant lo dalnrt No.
US 5 310 674 A (DEUTSCH M0RDECHAI ET AL)
10 May 1994 (1994-05-10)
abstract
1.2.6,7.
9-12.15,
17,20
column
3,
11
column
5,
11
column
7,
11
column
10,
1
column
12,
1
column
17,
1
column
18,
1
column
23,
28,
1
column
1
claims 1-
3,
-column 8, line 48
1-21
-/--
HI
Further documents are listed In the continuation of box C.
Patent family members are listed In annex
" Spedal categories of cited documents :
■A" document denning the general state of the art which Is not
considered lo be of particular relevance
'£• earfler document but published on or after the international
filing dale
V document which may throw doubts on priority claim (s) or
which Is cited to establish the publication dale of another
citation or other special reason (as spectied)
*0* document referring to an oral disclosure, use. exhibition or
other means
'P' document published prior to Ihe International filing date but
later man the priority date claimed
T» later document published after the international filing date
or priority dale and not In conflict wtth the application but
cited to understand the principle or theory underlying the
invention
"X" document of particular relevance; the claimed Invention
cannot be considered novel or cannol be considered to
Involve an Inventive step when the document Is taken atone
■V document of particular relevance; the claimed Invention
cannot be considered to involve an inventive step when the
document Is combined with one or more other such docu-
ments, such combination being obvious to a person skflled
m the an
document member of the same patent family
Date or the actual completion of the international search
11 August 2003
Date of mailing of the International search report
01/09/2003
1 mailing address of the ISA
European Patent Office, P.B. 5818 Patent laan 2
NL - 2280 HV Rijswfjk
Tel, (+31-70) 340-2040, Tx. 31 651 epo nl,
Fax: (+31-70) 340-3016
Authorized officer
Goetz, M
Form PCT/I3A/210 (second sheet) (July 1992)
INTEBMATIONAL SEARCH REPORT
Intomfitl^^AppJkfltlon No
PCT/EP 02/14764
C .(Continuation) DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category «
Citation of document, with Indication. where appropriate, of the relevant passages
Relevani to claim no.
WO 95 01559 A (EIGEN
KARSTEN (DE); THUERK
MIC) 12 January 1995
page 4, paragraph 2
page 9, paragraph 3
16, paragraph 6
paragraph 1
paragraphs
paragraph 3
paragraph 3
19,
page
page
page 23,
page 25,
page 26,
MANFRED ;HENC0
MARCEL (DE); DOERING
(1995-01-12)
-page 5, paragraph 1
-page 10, paragraph 2
-page 17, paragraph 3
-page 20, paragraph 1
1-3
1-3,5,6,
10,11,
17-21
claims 1,3,46,14,38; figures 14,18
DE 197 05 910 C (INST PHYSIKALISCHE
HOCHTECH EV) 18 June 1998 (1998-06-18)
column 1, line 57 -column 2, line 63
claims 1-4; figures 1-5
MAYER G ET AL: "Nanotiterplates for
combl nator 1 al cheml stry . "
JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY. NETHERLANDS DEC
2001,
vol. 82, no. 2, December 2001 (2001-12),
pages 137-159, XP002250641
ISSN: 0168-1656
the whole document
W0 01 94635 A (CH0U H0U PU ; QUAKE STEPHEN
R (US); CALIFORNIA INST OF TECHN (US))
13 December 2001 (2001-12-13)
the whole document
1-21
1,6,11,
16,19
1-21
1-21
1-21
Form PCT/1SA/210 (continuation of aooond short) (July 1082)
INTE
EBUA
tnf^ffatl
TIONAL SEARCH REPORT
istlon on patent family members
Intemotl^pAppllcstlon No
PCT/EP 02/14764
Kaieni aocunieni
patent family
Publication
cited In search report
date
member(s)
date
US 5310674
A
10-05-1994
US
5506141
A
09-04-1996
AT
29070
T
15-09-1987
AU
562301
B2
04-06-1987
AU
1401483
A
17-11-1983
BR
8302395
A
10-01-1984
CA
1202870
Al
08-04-1986
CS
8303223
A2
12-05-1989
DE
3373143
Dl
24-09-1987
DK
190583
A
11-11-1983
EP
0094193
A2
16-11-1983
ES
8407592
Al
16-12-1984
HU
195245
B
28-04-1988
IL
68507
A
31-01-1986
IN
159538
Al
23-05-1987
IN
168081
Al
02-02-1991
JP
1607661
C
13-06-1991
JP
2034597
B
03-08-1990
JP
59031685
A
20-02-1984
KR
8701670
Bl
21-09-1987
MX
163377
B
06-05-1992
NO
831637
A ,B,
11-11-1983
NZ
204056
A
05-12-1986
su
1776352
A3
15-11-1992
1 IC
Uo
A
A
no no moo
Q8-Q3-1988
us
5272081
A
21-12-1993
ZA
8303141
A
25-01-1984
AT
71664
T
15-02-1992
flu
594641
B2
i c no i nnn
15-03-1990
AU
3672884
A
03-06-1985
DE
3485462
Dl
27-02-1992
DK
308385
A
05-09-1985
EP
0162907
Al
04-12-1985
IP
61501126
T
1Z-0d-19o0
WO
8502201
Al
23-05-1985
WO 9501559
A
12-01-1995
DE
59405534 01
30-04-1998
WO
9501559 A2
12-01-1995
tr
0706646 Al
1 -j r\ a -1 one
17-04-1990
DE 19705910
C
18-06-1998
DE
19705910 CI
18-06-1998
WO
9835755 Al
20-08-1998
EP
1089821
Al
11-04-2001
JP
2001513695 T
04-09-2001
WO 0194635
A
13-12-2001
AU
7534001 A
17-12-2001
EP
1290226 A2
12-03-2003
UO
0194635 A2
13-12-2001
US
2002037499 Al
28-03-2002
Form PCT71SA/210 (patonl family anrwx) (July 1002)
INTERNATIONALEAflECHERCHENBERICHT
In tarn ail Aktenxelchen
PCT/EP 02/14764
A. KLASSIRZIERUNG DES ANMELDUNOSGEQENSTANDES
IPK 7 G01N33/543 G01N33/552 B01J19/00 B01L3/00
Nach der Internal lonalen Patentidassifikatlon (IPK) Oder nach der natlonaten Kbssffitetlon und der IPK
B. RECHERCHERTE GEB1ETE
Recherchierter MindestprGtstofl (Klaaalflkatlonasystem und Ktasaffikationseymbole )
IPK 7 G01N B01J BOIL
Recherchierle aber nicht zum MindestprOfaoff gehorende VerBffentBchungen. sowelt dtese unter die rechercWerten Gebtete fallen
Wahrend der tntemattonalen Recherche KonsuHterte elekJronlsche Datenbank (Name der Daienbank und evtt. verwendete Suchbegriffe)
EPO-Internal , WPI Data, PAJ, BIOSIS, EMBASE, MEDLINE
C. ALS WESENTLICH ANQESEHENE UNTERLAGEN
Kalegorie* Beretchnung der VerOrfentllchurg, soweit erforoeriich unter Angabe der in Batracht kommenden Telle
Betr. Anspruch Nr.
US 5 310 674 A (DEUTSCH MORDECHAI ET AL)
10. Mai 1994 (1994-05-10)
Zusammenfassung
Spalte 3, Zelle 59 -Spalte 4, Zelle 39
Spalte 5 f Zelle 36-57
Spalte 7, Zelle 5 -Spalte 8, Zelle 48
Spalte 10, Zelle 12 -Spalte 11, Zelle 46
Spalte 12, Zelle 6-29
Spalte 17, Zelle 32-37
Spalte 18, Zelle 25-65
Spalte 23, Zelle 30 -Spalte 25, Zelle 6
Spalte 28, Zelle 46 -Spalte 29, Zelle 30
Anspruche 1-3,7,12,13; Abblldungen 18-36
-/-
1,2,6,7,
9-12,15,
17,20
1-21
Wettere Veroffentllchungen slnd der Fortsetzung von Feld C zu
0
Stehe An hang Palentfamllle
* Besondere Kaiegorlen von angegebenen veroffentllchungen
•a* VeroRentnchung, die den atlgemeinen Stand derTechnlkdeflnlert,
aber r.kht a Is besondere bedeutsam anzusehen 1st
"E* atleree Dokument, das jedoch erst am odor nach dem Intern atlonalen
Anmeldedatum verOffentllcht worden 1st
■f VerOffentlichung. die geafgnel 1st. einen PAort&tsanapruch zwelfelhaft er-
schflinen zu lassen. Oder durch die das VerOtfentlchungsdatum einer
anderen Im Recherchenbenchl genannten VerOffentfchung belegt werden
soil Oder die aus elnem anderen besonderen Grund angegeben tsi (wte
ausgefQhrt)
'O* Veroffentllchung, die aich auf elne mtlndllche Often baaing.
eine Benutzung, elne Aussteltung oder andere Maflnahmen bezlaht
■P" VeroffentOchung, die vor dem tntemallonalen Anmeldedatum, aber nach
dem beans pnjch ten PrlorHatsdatum veroffentHcht worden 1st
T Spfltere Verorrentllchung. die nach dem imemaiionalen Anmeldedatum
oder dem Prioritatsdatum verOfTantllcht worden 1st und mfl der
Anmeidung nicht kolBdten, eondem nur zum Verstandnls des der
Erfindung ajgrundelleaendan Prinzlps oder der ihr zugrundeliegenden
Theorie angegeben bt
"X* Verdtfentlichung von besonderer Bedautung; die beanspruchte Erflndung
kann atleln aufgrund deser VerQffentiichung nicht ais neu oder auf
erflMtenscherTaltgketl beruhend betrachtet werden
"Y" VerOffemllchung von beeonderer Bedautung; die beanspruchte Erflndung
kann nicht als auf erfindBrischer Tallgkatt beruhend betrachtet
werden, wenn die Veroffentllchung mtt einer oder me h reran anderen
Veroffentllchungen dieser Kalegorla in Verblndung gebracht wind und
dlese Verblndung fQr elnen Fachmann nahellegendlst
Veroffentllchung, die Mitglleddereolben Palenttamilte 1st
Datum des AbacNusses der tntemallonalen Recherche
11. August 2003
Absendedatum dee Intomationaten Recherchenbertchts
01/09/2003
Name und Postanschrtft der mtematlonalen Recherchenbehdrde
Europaischee Paientamt, P.B. 5B18 Patentlaan 2
NL - 2280 HV Rijswljk
Tel. (431-70) 340-2040, Tx. 31 651 epo nl,
Fax; (431-70) 340-3016
BevoQmflchltgler Bed ten staler
Goetz, M
Fmmbtott PCT/1SA/210 <BM 9) (Jull 1 992)
INTERNATIONAL^ftflECHERCHENBERICHT
Internstl^^s Aktenzelehen
PCT/EP 02/14764
C^FortoeUung) ALS WESENTLICH ANQESEHENE UNTERLAGEN
Kalegorte* Berolchnung der VerOflenttlchung, soweiterfordsrith untsr Angabe der In Betracht korm»nden Teite
Betr. Anspruch Nr.
WO 95 01559 A (EIGEN MANFRED ;HENC0
KARSTEN (DE); THUERK MARCEL (DE); DOERING
MIC) 12. Januar 1995 (1995-01-12)
Selte 4, Absatz 2 -Seite 5, Absatz 1
Selte 9, Absatz 3 -Seite 10, Absatz 2
Seite 16, Absatz 6 -Seite 17, Absatz 3
Seite 19, Absatz 1 -Seite 20, Absatz 1
Seite 23, Absatze 1-3
Seite 25, Absatz 3
Selte 26, Absatz 3
AnsprQche 1,3,46,14,38; Abblldungen 14,18
DE 197 05 910 C (INST PHYSIKALISCHE
HOCHTECH EV) 18. Junl 1998 (1998-06-18)
Spalte 1, Zeile 57 -Spalte 2, Zelle 63
AnsprCiche 1-4; Abblldungen 1-5
MAYER G ET AL: "Nanotiterpl ates for
combinatorial chemistry."
JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY. NETHERLANDS DEC
2001,
Bd. 82, Nr. 2, Dezember 2001 (2001-12),
Selten 137-159, XP002250641
ISSN: 0168-1656
das ganze Dokument
WO 01 94635 A (CHOU HOU PU ; QUAKE STEPHEN
R (US); CALIFORNIA INST OF TECHN (US))
13. Dezember 2001 (2001-12-13)
das ganze Dokument
1-3,5,6,
10,11,
17-21
1-21
1,6,11,
16,19
1-21
1-21
1-21
FormbWI PCTVISA/210 (Fortsatzung von Bltttt 2) (Jufl 1002)
INTERNATIONALE*
Anoaben zu VerOtreruiJchungsn
i. aS ;
CHERCHENBERICHT
2ur seiben Paientramflie genoran
5 AWenzelchgn
Intematlo^^
PCT/EP 02/14764
lm Recherchenbericht
angefuhrtes Patentdoku merit
Datum der
VerOffentDchung
Mitgiied(er) der
Patentfamilie
Datum der
VerOffentilchung
US
5506141
A
OQ-Od-lQQfi
U7 Ut 1 J JU
AT
29070
T
15-09-1987
X «J \#7 130/
AU
562301
82
04-06-1987
AU
1401483
A
17-ll-1Qftt
BR
8302395
A
i n-oi -ipsa
CA
1202870
Al
08-04-1 Q86
CS
8303223
A2
DE
3373143
Dl
24-09-1987
DK
190583
A
11-11-1983
xx X X X JOJ
EP
0094193
A2
XV XX X 7QJ
ES
8407592
Al
16-12-1984
1U XX. 170*t
HU
195245
B
28-04-1988
Tl
1 L.
68507
A
IN
159538
Al
23-05-1987
C%J W 170/
IN
168081
Al
02-02-1991
Ut Vt. 1771
JP
1607661
XVw/ W X
c
13-06-1991
X «J W 1771
JP
2034597
B
03-08-1990
177U
JP
59031685
A
20-02-1984
KR
8701670
Bl
21-09-1987
Cm X W 7 X 70/
MX
163377
B
06-05-1992
W VW X 7 J £»
NO
831637
A t B,
11-11-1983
NZ
204056
A
05-12-1986
SU
1776352
A3
15-11-1992
US
4729949
A
08-03-1988
US
5272081
A
21-12-1993
ZA
8303141
A
25-01-1984
AT
71664
T
15-02-1992
AU
594641
B2
15-03-1990
AU
3672884
A
03-06-1985
DE
3485462
01
27-02-1992
DK
308385
A
05-09-1985
EP
0162907
Al
04-12-1985
JP
61501126
T
12-06-1986
WO
8502201
Al
23-05-1985
US 5310674
10-05-1994
W0 9501559
A
12-01-1995
DE
59405534 Dl
30-04-1998
UO
9501559 A2
12-01-1995
EP
0706646 Al
17-04-1996
DE 19705910
C
18-06-1998
DE
19705910 CI
18-06-1998
UO
9835755 Al
20-08-1998
EP
1089821 Al
11-04-2001
JP
2001513695 T
04-09-2001
U0 0194635
A
13-12-2001
AU
7534001 A
17-12-2001
EP
1290226 A2
12-03-2003
UO
0194635 A2
13-12-2001
US
2002037499 Al
28-03-2002
Foimbtatt PCT/ISA/210 (Anhang pBtnntlam»i«)(Jufi 1002)
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□ BLURRED OR ILLEGIBLE TEXT OR DRAWING
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